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crRNA合成

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优异的crRNA合成和纯化技术,提供优质的crRNA合成服务,运用于基因编辑,基因检测等领域,独家的长链RNA合成技术,支持1nt--100nt crRNA合成,可选择LNA,2-OMe等稳定RNA的修饰,可提供各种复杂类型的定制修饰;

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      2024年4月在国际化学顶级期刊Angewandte Chemie International Edition》杂志上发表了一篇题为“Universal crRNA Acylation Strategy for Robust Photo‐Initiated One‐Pot CRISPR–Cas12a Nucleic Acid Diagnostics”的文章。
      该文章通讯作者是来自湖南师范大学化学化工学院的杨荣华教授和熊二虎教授。本文创新的提出了一种用于增强CRISPR-Cas12a核酸诊断能力的通用crRNA乙酰化策略,该策略通过高效的crRNA乙酰化,结合光可控制剂(PLGs),实现了CRISPR-Cas12a反应的高效抑制及光照下的快速恢复,这一过程不受crRNA序列的影响,显示出极好的通用性和方便性

    研究团队构建了一个通用的PhotO-Initiated CRISPR-Cas12a system for Robust One-pot Testing (POIROT)平台,与重组酶聚合酶扩增(RPA)技术整合,显示出比传统一步法测定更高的灵敏度,与两步法测定相当。对于临床样本检测,POIROT在灵敏度和特异性方面与金标准的定量PCR(qPCR)方法相当,但速度更快。

乙酰化crRNA对CRISPR-Cas12a系统活性的抑制

使用不同乙酰化时间处理的crRNA与Cas12a和目标DNA结合,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光动力学分析展示了乙酰化crRNA能显著抑制Cas12a的靶向DNA切割(cis-cleavage)和非特异性单链DNA切割(trans-cleavage)活性。

光诱导去乙酰化恢复CRISPR-Cas12a活性

将完全乙酰化的crRNA进行不同时间的365 nm紫外光照射处理,随后的PAGE和荧光动力学分析显示,光照射能够有效地去除PLG修饰,恢复crRNA的活性,从而恢复CRISPR-Cas12a系统的切割活性。

光控CRISPR-Cas12a系统活性的通用性和可访问性验证

对多个具有不同spacer区域的crRNA进行乙酰化处理,并通过荧光动力学分析检测其在光照射后CRISPR-Cas12a活性的恢复情况。结果表明,无论crRNA序列如何,乙酰化和光诱导去乙酰化策略都能有效地控制CRISPR-Cas12a系统的活性。

    POIROT平台整合逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)或RPA与光启动的CRISPR-Cas12a系统进行核酸检测的流程。在这个平台中,RT-RPA/RPA首先被用于获取DNA扩增产物,随后通过光照射启动CRISPR-Cas12a系统进行核酸检测。
    通过在不同类型的核酸(如SARS-CoV-2 RNA和HPV DNA)检测中的应用,证明了POIROT平台不仅技术创新,而且具有实际应用的潜力,特别是在需要快速、准确诊断的传染病检测和监测领域。

表S5对比了两步测定法、传统一步测定法、传统光控一锅法和POIROT测定法在核酸检测中的技术特点。

     文中crRNA化学合成及修饰均由湖州河马生物科技提供

参考资料:

[1] Liu P, Lin Y, Zhuo X, et al. Universal crRNA Acylation Strategy for Robust Photo‐Initiated One‐Pot CRISPR–Cas12a Nucleic Acid Diagnostics[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024: e202401486.

版权说明:本文来自河马生物,欢迎个人转发,媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。


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